如何评估FFPE蜡块切片过程中RNA的降解程度和质量？
在抽提RNA前，哪些预处理步骤是必要的以保证RNA的完整性和纯度？
从FFPE样本中提取RNA有哪些常见问题，以及如何解决？
针对40-60个样本量，如何设计一个高效的RNA提取流程以保证每个样本提取的一致性？
发送提取的RNA前，应通过哪些检测手段验证样本的质量是否符合下游应用的需求？
虽然定期修订的卫生组织标准指出FFPE样本中的RNA通常会遭受一定程度的降解和化学修饰，但通过适当的评估方法仍可以评估RNA的质量。
1. **使用纳米孔或RNase P检测**：利用生物分析仪（例如Agilent 2100 Bioanalyzer）进行RNA完整性检测，采用RNA完整性数（RIN）来表示RNA的降解程度，而一个优质的FFPE样本应该具有较高的RIN值。
2. **RT-qPCR测试**：通过定量PCR技术检测特定基因表达来评估RNA的质量。这种方法利用RNA降解抗性较强的基因作为内参，质量较差的RNA会导致CT值升高。
从FFPE样本中提取RNA前，必须进行以下预处理步骤：
1. **去蜡**：使用去蜡剂（如石烷、去蜡液或十六烷）彻底去除包埋样本中的石蜡。
2. **蛋白酶K消化**：使用蛋白酶K处理样品以消化蛋白质和提高RNA释放。
3. **逆交叉联**：在适当的温度下孵育样本，以解除由甲醛引起的RNA交叉联。
从FFPE样本中提取RNA时常常会遇到以下问题和相应的解决方案：
1. **RNA降解**：使用更温和的条件和快速的处理步骤以减少RNA进一步降解。
2. **化学修饰**：采用特殊的提取步骤和试剂来逆转化学修饰。
3. **提取效率低**：优化消化并使用高效的RNA纯化试剂盒增加提取效率。
4. **DNA污染**：纳入DNase处理步骤以去除DNA污染。
为了处理40-60个样本的大量样本，需要设计一个标准化、自动化的流程，确保每个样本提取的一致性：
1. **标准化工作流程**：为所有样本设定明确的操作规程和时间点，包括去蜡、消化和提取。
2. **批量处理样本**：采用可以处理多个样本的试剂盒和设备，比如具备批处理功能的自动化核酸提取设备。
3. **质量控制**：为每批样本设立质控，包括正常控制和无模板控制（NTC）。
4. **技术人员培训**：确保所有操作人员均经过充分培训，同一人完成同一批样本的处理以减少个体差异。
RNA提取后进行质量评估是关键一步，以下是一些验证手段：
1. **生物分析仪**：如前所述，使用生物分析仪检测RNA完整性。
2. **RT-qPCR**：通过RT-qPCR检测特定RNA靶标的CT值，间接评估RNA质量。
3. **紫外光谱光度计**：测量260/280和260/230纳米值以评估RNA的纯度和浓度，纯净的RNA应该有一个260/280值接近2.0。
4. **胶电泳**：对RNA样品进行胶电泳，观察RNA是否降解（如出现轻微降解的较小RNA条带）。
事实案例：
例如，在提取具有较高RIN值（>7.0）的RNA后，研究人员运用生物分析仪和RT-qPCR确认了RNA从40个FFPE样本中成功提取，并且质量符合下游应用如转录组学分析的标准。通过这些预处理、提取流程标准化和质量验证步骤，确保了从FFPE样本中提取RNA的高效性和一致性。